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                RNA-direct™ Realtime PCR Master Mix 系列

                用途

                Realtime RT-PCR

                說明

                Tth DNA polymerase是在Mn2+存在下,具有很強的逆轉錄活性的獨特的酶,在單一反應體系內可進行cDNA的合成及PCR的連續反應。利用該特性,開發出單酶一步法定量PCR試劑盒,與在同一反應中使用RTase及Taq DNA polymerase的「兩酶一步法」體系試劑相比,使用單酶時,最適反應條件的設定較容易,而且能夠得到更高的分析效率。


                特征

                ●一步法高通量分析
                本品以RNA為模板,能夠在同一反應體系內進行定量PCR分析,非常適合于需要快速分析的多重檢測體系。


                ●特異性高
                本品采用抗體法熱啟動,對控制非特異性擴增非常有效。

                ●適用性廣
                探針法及SYBR®Green I 法都可以適用。


                ●可用于不同類型的儀器
                因為含有參比染料(Passive reference),可適用于需要校正的檢測儀器(如Applied Biosystems®StepOnePlusTM等)。


                ●可用于易于形成高級結構的RNA和高GC含量的模板
                可用于使用玻璃毛細管型的檢測儀器(如Roche Diagnostics公司的LightCycler® )。
                逆轉錄反應在高溫下進行,所以也適用于易于形成高級結構的模板RNA。而且,眾所周知,Tth DNA polymerase對GC含量高的序列的擴增效率非常高,可有效檢測GC含量高的目的片段。

                實驗例

                1.與『兩步法體系(RTase + Taq)』相關性的比較

                通過以各種人組織來源的RNA為樣品,對蛋白酶δ(PKCδ)的表達進行分析,比較了與使用一般的兩步法的熒光定量PCR分析法的相關性。
                黃色柱狀圖表示的是使用本產品的定量結果,左邊是使用50ng、右邊是使用200ng的Total RNA得到的結果。藍色柱狀圖表示的是使用本公司高效率逆轉錄試劑盒「ReverTra Ace -α-®」[FSK-101]與Taq酶為基礎的熒光定量PCR試劑「SYBR®Green Realtime PCR Master Mix -Plus-」[QPK-212]組合的兩步法體系檢測的結果。

                結果顯示,使用一步法的本產品與兩步法體系得到了相同的結果。

                2. TaqMan®探針法分析的性能比較

                RNA-directTM與兩酶一步法(儀器:使用BioFlux公司的Line Gene)
                以mRNA為模板,與使用Taq+RTase混合型的A公司的試劑(兩酶一步法體系)進行了比較實驗。
                以人培養細胞提取的mRNA(10n倍稀釋系列(n=2))為模板,用TaqMan®探針法對β-actin的mRNA進行檢測(作100倍稀釋,使用20μl反應液中含有5ng的Poly(A)+RNA)。結果顯示,使用RNA-directTMRealtime PCR Master Mix的反應中,即使使用A公司試劑推薦的反應條件,也會得到起峰早及直線性的良好結果。

                3. SYBR®Green分析法中直線性的討論

                RNA-directTM與兩酶一步法(儀器:使用ABI公司的PRISM®7900HT)
                以HeLa細胞來源的Total RNA(10n倍稀釋系列(n=2))為模板,用SYBR®Green分析法檢測β-actin的mRNA(作100倍稀釋,使用20μl反應液中含有75ng的Total RNA)。
                結果顯示,與Taq+RTase混合型的B公司試劑盒相比,RNA-directTMSYBR®Green Realtime PCR Master Mix的反應中,至少可以在7個梯度的稀釋系列中表示出高度相關性。

                4. SYBR®Green分析法中性能的比較

                RNA-directTM與一酶一步法(儀器:使用Roche公司的LightCyclerTM)
                以人培養細胞提取的Poly(A)+RNA(10n倍稀釋系列(n=2))為模板,用SYBR®Green分析法檢測G3PDH 的mRNA (作100倍稀釋,使用20μl反應液中含有5ng的Poly(A)+ RNA)。
                結果顯示,與同樣使用Tth DNA Polymerase的C公司試劑相比,RNA-directTMSYBR®Green Realtime PCR Master Mix的檢測中,起峰早、信號強以及檢測靈敏度都得到了極大提高。

                產品內容

                〈QRT-101, QRT-201〉
                Master Mix0.5ml ×5支
                50mM Mn(OAc)20.5ml ×1支
                (50μl反應體系可使用100次,20μl反應體系可使用250次)


                保存 -20℃(避光保存)

                基本反應條件

                〈SYBR® Green I 法〉
                使用ABI PRISM®7900HT(Applied Bio.)
                滅菌水X μl
                Master Mix25μl
                50mM Mn(OAc)22.5μl
                各Primer10pmoles each
                RNA樣品<1μg

                Total Volume50μl



                Cycle
                90℃    30sec.
                61℃    20min.
                        ↓
                95℃    60sec.
                        ↓
                95℃    15sec.
                *55~65℃    15sec. 45cycles
                74℃    45sec.

                ※退火溫度,請根據引物的Tm在55~65℃范圍內進行調整。

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