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                ReverTra Ace®

                用途

                1鏈cDNA的合成

                說明

                RNaseH活性在cDNA合成中,會分解作為模板/引物的DNA-RNA雜交體中的RNA,導致反
                應效率下降。而本酶可降低該RNaseH活性。ReverTra Ace®通過在M-MLV(Moloney Murine Leukemia Virus) RTase基因的RNaseH活性結構域導入點突變,降低了該活性。
                另外,RNA的高級結構會阻礙RTase反應的進行,使得cDNA合成困難。本酶通過在DNA合成結構域導入點突變,提高了反應效率及高溫反應性能,所以可在高溫下進行反應。因此,可通過提高反應溫度來緩和模板RNA的高級結構,可促進RTase對cDNA的合成反應。

                另外,本酶比原有的deletion型M-MLV RTase RNaseH−相比,高出其約4倍的活性,可高效率地進行cDNA合成。



                特征

                ●提高了延伸性
                去除了M-MLV RTase的RNaseH活性,延伸性有了明顯的提高。


                ●提高了反應效率?高溫反應性
                通過在M-MLV RTase的DNA合成區域中導入點突變及改良反應組分,提高了高溫反應性和反應效率。


                ●最適合于RT-PCR
                可在各種條件下進行逆轉錄反應,特別適用于RT-PCR。


                原理


                實驗例

                1.  42?60℃時的cDNA合成反應
                以帶有poly(rA) Tail,長度分別為9.49、7.46、4.40、2.37、1.35kb的RNA 0.4μg為模板,以oligo(dT)2025pmoles為引物,在42?60℃的反應條件下,用本酶100U,進行30min.的cDNA合成反應。

                結果顯示,用ReverTra Ace,在42℃及50℃時生成了9.49kb、55℃生成了4.4kb、60℃生成了2.37kb的cDNA合成產物。


                2. cDNA合成效率的比較
                以在in vitro條件下合成的G3PDH的RNA 102?105copies為模板,使用G3PDH的下游引物,42℃、20min.進行cDNA合成反應后,加入G3PDH上游引物,用rTaq DNA Polymerase(Code No.TAP-201)進行PCR反應。
                結果可見,用ReverTra Ace,即便是以102copies的RNA為模板合成的cDNA為模板,也可確認到擴增產物。




                3.  14kb的cDNA合成反應
                以Human骨骼肌poly(A) RNA為模板,使用dystrophin mRNA的3'端的特異性cDNA合成用引物,42℃、30min.進行cDNA合成反應后,使用mRNA的5'端特異性PCR引物對(位于cDNA合成引物上游14kb處),用KOD Dash(Code No.LDP-101)進行PCR,判斷有無延伸。
                結果可見,使用ReverTra Ace,可合成14kb以上的cDNA。




                產品內容

                ReverTra Ace®(100U/μl)   100μl

                5×Buffer* (TRT-1B)    1ml



                *5×Buffer中不含有dNTPs。



                組分:

                50mM          Tris-HCl (pH7.5)

                100mM         NaCl

                0.1mM          EDTA

                10mM           DTT

                0.01%           Nonidet® P-40

                50%              Glycerol



                活性的定義:

                以Poly(rA):Oligo(dT)20為模板/引物,在42℃下,10分鐘內攝入1nmole的dTTP使成為酸不溶性沉淀物時所需的酶量為1U。



                純度:

                50U的本酶和0.2μg的MS2 RNA在42℃下反應1小時,RNA電流模式未見變化。



                來源:

                E.coli 重組體

                基本反應條件

                滅菌蒸餾水        Xμl

                模板RNA

                  total RNA       100-1000ng

                  poly(A)+ RNA    50-500ng

                Primer

                  oligo(dT)       5pmoles

                  random          25pmoles

                  gene specific   5pmoles

                5×Buffer         4μl

                10mM dNTPs        2μl(1mM)

                ReverTra Ace®(100U/μl)  1μl(100U)

                RNase Inhibitor   1μl

                Total Volume      20μl



                30℃, 10min*

                42℃, 20-60min.

                99℃, 5min.



                *該步驟只在使用Random Primer時需要。



                <1st strand DNA合成>

                滅菌蒸餾水Xμl

                poly(A)+ RNA 0.4μg

                oligo(dT) 25pmoles

                5×Buffer 4μl

                10mM dNTPs 2μl(1mM)

                ReverTra Ace®(100U/μl)  1μl(100U)

                RNase Inhibitor 20U

                Total Volume 20μl



                42℃, 30min.

                99℃, 5min.


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