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                Ligation high

                用途

                DNA連接

                說明

                本試劑是以T4 DNA Ligase為主體的高效率單管型連接試劑,廣泛應用于各種末端DNA的連接反應。通過組分條件的優化,使之對凍結/融解的穩定性和反應效率大大提高。是含有連接反應所需要的rATP?DTT等的單管連接試劑。使用時只需按DNA樣品溶液的1/2?同等量加入Ligation high,就可以得到比單獨使用T4 DNA Ligase更好的結果。


                特征

                簡便
                只需在DNA樣品中混入Ligation high,便可進行高效率的連接反應。


                高效率
                與單獨使用T4 DNA Ligase相比,可獲得50倍以上的效率。


                高穩定性
                經實驗確認,即使反復凍融50次,也不會降低連接反應的效率。

                實驗例

                1.反復凍融時的穩定性

                凍融后,按推薦說明書進行連接反應。結果表明:即使反復凍融50次,也不會降低連接反應的效率。

                2. 鹽濃度的影響

                本實驗探討DNA溶液中所含的鹽(NaCl)濃度對連接效率的影響。
                將用SacⅠ切斷的pBluescript®Ⅱ(5ng)混入不同鹽濃度的TE Buffer 5μl中,以觀察DNA溶液中所含的鹽成分對自連接效率有多大影響。方法如下:在DNA 片段溶液中添加與其等量或一半量的Ligation high,16℃條件下反應30min.,取2μl用于轉化,檢測出現的菌落數。
                結果顯示,NaCl濃度越高,連接反應效率越低。
                因此,對溶解在限制酶H Buffer等高鹽濃度反應液的DNA用于連接反應時,建議先置換成TE buffer。


                3.反應時間對PCR產物TA克隆的影響

                使用本試劑,將PCR產物插入到T載體中,觀察反應時間對實驗的影響。實驗方法如下:先以λDNA 500bp為目的片段,用rTaq DNA Polymerase進行。將該反應液1μl (約6.4ng)和2μl的T載體(50ng)添加到3μl的Ligation high中,在16℃條件下進行不同時間的溫育,再進行連接反應。然后再用各反應液2μl進行大腸桿菌轉化,測定白斑和藍斑的數量。
                結果顯示,反應時間越長,效率越高,16小時效果最好。2小時以上,藍斑的數量沒有明顯變化,而時間越長白斑的數量越多。因此,用Ligation high進行PCR產物的TA克隆時,如想要獲得高插入率,建議反應時間在2小時以上,最好是16小時。


                ※想在短時間內進行TA克隆時,推薦使用Ligation high Ver.2。

                4. 反應時間的探討

                用λ/HindⅢ酶切,用Ligation high在16℃條件下進行不同長度時間的連接反應,EtOH沉淀后進行電泳。
                結果可見,HindIII酶切末端,約5min.即可完成充分的連接反應。 

                產品內容

                Ligation high 375μl ×2支


                ※1次使用15μl時,可使用50次。

                注意事項

                本試劑中有時會出現沉淀,這是由于作為穩定劑用的BSA形成的,對連接效率沒有影響。請勿加溫使其溶解,直接使用即可。同時,無須混合使沉淀均質狀態,直接將不含沉淀的部分用于反應即可。

                基本反應條件

                載體+插入DNA 15μl

                Ligation high 7.5~15μl

                16℃、30-60min.

                向100μl的Competent cell中加入大約10μl的反應溶液,進行轉化。

                ※在用電穿孔法進行轉化時,請將反應液進行脫鹽或乙醇沉淀法對DNA進行純化。

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