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                Ligation high Ver.2

                用途

                DNA連接

                說明

                本試劑是以T4 DNA Ligase為主體的高效率單管型連接試劑,廣泛應用于各種末端DNA的連接反應。通過對原產品進行改良,可簡便地用于各種用途。本試劑是在原產品『Ligation high』基礎上改良的使用更方便的高效率單管型連接試劑。只需與DNA片段混合,進行短時間反應,即可高效率地進行連接??蓮V泛用于突出末端、平滑末端及TA克隆等方面。


                特征

                ●高效率  
                特別是TA克隆效率得到了大幅度的提高。下圖是用各公司試劑盒對TA克隆效率的比較。

                ●即使在-20℃保存也不會凍結
                從冷凍柜中取出后可立即使用。右圖表示-20℃保存時試劑的狀態[原來的產品:Ligation high〈綠〉、本產品:Ligation high Ver.2〈藍〉]。 

                ●簡便的單管型

                使用方法與原有產品一樣,只要將試劑和DNA片段混合即可,非常簡便。

                實驗例

                1.DNA末端形狀與連接效率的關系

                在16℃條件下反應時,將DNA片段(0.5kb)的克隆效率與末端形狀進行比較。結果可見,突出末端的連接約5分鐘即可完成,而平滑末端及TA克隆30分鐘約完成70?80%。另外,平滑末端克隆及TA克隆時間超過1小時,到2小時為止,連接效率會逐漸提高。因此當克隆效率比較低時,可將反應時間提高至2小時左右可提高連接效率。

                2.使用未經純化的PCR產物的TA克隆

                 將T載體(50ng, 25fmol)和具有良好擴增效率的未純化PCR產物(用Taq DNA polymerase擴增的0.5kb片段)按照各種比例混合,在該DNA溶液〈7.5μl〉中添加Ligation high Ver.2〈7.5μl〉,在16℃條件下反應30分鐘。然后,用10μl反應液對E. coli DH5α感受態細胞〈100μl〉進行轉化,用LB/Amp(X-Gal)培養基培養后點克隆數。結果可見,盡量少帶入PCR反應液可得到良好的結果?!∮捎谟眉兓蟮腄NA片段可得到高效率,因此當效率低下時,可使用純化后的PCR產物。 

                產品內容

                Ligation high Ver.2    750μl

                ※1次使用7.5μl時,可使用100次。

                注意事項

                ●在−30℃以下長期保存,或在冷凍柜的冷氣出風口處保存時,可能會產生凍結現象。經實驗證明,5次反復凍融不會影響試劑活性,但注意請盡量不要使其凍結。產生凍結時,可用手指捏著離心管使其融解,但注意不要使其升溫。

                ●產生白色沉淀時也可按照上述方法將沉淀溶解后正常使用。

                基本反應條件

                載體+插入DNA    7.5μl

                Ligation high Ver.2  3.75~7.5μl*

                16℃、30min.

                向100μl的Competent cell中加入大約10μl的反應溶液,進行轉化。

                *TA克隆時,用7.5μl進行反應。

                ※在用電穿孔法進行轉化時,請將反應液進行脫鹽或乙醇沉淀法對DNA進行純化。

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